Tel:025-58117100

Search
>
技术优势
技术优势Technical advantage

● 脱细胞技术优势

☞现有技术方案

目前国内外市场上脱细胞产品的制备方法,主要采用了第一代的非特异性脱细胞方法。主要包括:1 物理法;2 化学法;3 酶法。依据组织器官的结构特点,通常的脱细胞方案是选取物理法,化学法和酶法中的一种或几种组合使用。

该类方法由于不具备细胞特异性,均不可避免的导致细胞外基质成分的丢失,尤其是可溶性的蛋白多糖和糖蛋白成分,丢失率可达 80%。因此只适用于处理一些技术要求不高,质地较硬,富含弹力纤维的组织(皮肤,大血管,心瓣膜,气管,心包膜)。在活体应用中均出现力学强度降低,生物降解较快的副反应。因此,该类方法无法制备较为精密的脱细胞组织(脱细胞角膜基质,脱细胞真皮网)。

☞本公司的创新

1).已开发第二代精密脱细胞基质产品的特异性制备方案

为了提高产品性能,满足临床治疗效果,必须克服现有技术的缺陷,降低细胞外基质成分的丢失率。为此,我们设计了利用磷脂酶的第二代特异性脱细胞方法,这种脱细胞方案可较好的保留产品的力学性能和生物学活性,除用于常规产品的脱细胞外,可用于制备组织结构较为精密的产品:角膜、粘膜,皮肤的真皮层等,但由于仍有一定量细胞外基质流失,移植后愈合时间较长。以角膜为例:患者恢复视力的时间较长,约为6~12月。

2).已建立第三代高端精密脱细胞基质产品的特异性制备方案

在第二代产品的基础上,研发了更为缓和精细的脱细胞方案,利用诱导细胞凋亡的脱细胞方法,减少了外界施加过多理化因素对细胞外基质成分的破坏性副反应;将有效降低蛋白多糖的丢失率,显著提高临床治疗效果。通过特异性交联方法,可实现生长因子微球在去细胞角膜基质中的缓控释放,从而实现改善术后愈合的目的。细胞外基质的保留率相对于二代产品可增加2~3倍,大大提高产品性能,加速组织愈合。以角膜为例:制备的角膜产品恢复透明的时间较短,约为1~2周。

脱细胞改进方案示意图。

A.第二代特异性脱细胞方案(磷脂酶法)。

B.第三代特异性脱细胞方案(联合诱导凋亡法和磷脂酶法)。

对照现行方法的特征可以看出,第三代脱细胞方案将会产生以下明显优势:

·主动凋亡的脱细胞方式,理论上减少了脱细胞反应的外加能耗。减少了外界施加过多理化因素对细胞外基质成分的破坏性副反应。相对于传统脱细胞方法(直接施加过量的物理,化学和裂解酶的作用,细胞被动破裂或细胞直接凝固性死亡),诱导凋亡的脱细胞方法可以极低的代价产生完整活细胞有效分解的效应。

·主动凋亡的脱细胞方式,还可有效地实现细胞成分的自发分割和降解,为后续细胞成分的清除带来极大便利。细胞凋亡后形成的凋亡小体,虽然也是闭合双分子层结构,但其通透性已显著增加,细胞核裂解,粘稠的染色质和胞浆蛋白被均匀分散在形态和结构均较为均一的凋亡小体中,在清除细胞碎片第二阶段,相对于传统方法脱细胞时产生的大小不一的细胞残片而言,则会产生极大便利,也更容易实现生产工艺的标准化。

☞比较优势

绝大部分去细胞基质产品其制备技术均来源于第一代技术,由于产品制备技术落后,生物相容性力学强度无法满足临床应用的要求,该类产品主要起到覆盖创面的作用,移植体内后降解很快。对于市场容量最大且技术难度最高的“脱细胞粘膜网”和“脱细胞角膜基质”,现有技术还无法做出适合临床的较好产品。

本公司在第二代产品的基础上,研发了更为缓和精细的脱细胞方案,细胞外基质的保留率相对于二代产品可增加2~3倍,大大提高产品性能,加速组织愈合。以角膜为例:制备的角膜产品恢复透明的时间较短,约为1~2周。具体区别见下表

 

脱细胞技术比较

 

第一代脱细胞技术

第三代脱细胞技术

技术原理

物理法、化学法、酶法

诱导凋亡法

脱细胞作用

非特异性

特异性

脱细胞效率

90%~99%

90%~99%

结构蛋白保留率

80%~90%

大于 99%

蛋白多糖保留率

小于 20%

大于 80%

生物力学

降低至 80%以下

无显著降低

细胞黏附和增殖能力

显著降低

无显著降低

愈合时间

较长

较短,约为一代技术的 1/5

制备产品

心包膜、皮肤、血管等致密组织

粘膜、角膜等精密或疏松组织。

也可制备心包膜、皮肤、血管等致密组织。

 

● 干细胞-再生修复技术优势

☞现有技术方案

本领域运用最为广泛的技术是温度反应性培养皿法制备的细胞片产品(下图)。该方法的优点在于控制简单条件而实现细胞片与培养容器的分离,但却存在明显缺陷:细胞片可能会存在有机物质的残留,而且操作难度大。因此,亟需研发一种可维持干细胞生物学活性的新一代干细胞补片制备技术,进一步提高干细胞补片的临床治疗效果,同时也打破日本科学家在该领域的技术垄断。

 

 

☞本公司的创新

本公司项目中,对于无需力学支持的应用方向(眼表缺损,重要脏器粘膜缺损,大血管壁内膜损伤等)(下图),使用携带自杀基因的支持细胞作为饲养层细胞,发挥营养支持作用;然后借助纳米多肽凝胶的快速三维重建作用,将足量干细胞直接固定在支持细胞表面;待干细胞实现较好融合后,启动饲养层支持细胞的自杀基因,使支持细胞自杀凋亡,从而实现饲养层与心肌补片产品的分离。最终可收获带有完整细胞外基质及良好生物学活性的干细胞补片。(发明专利申请号:201310611198.2)。

 

 

无载体干细胞补片制备方案模式图

对于需要力学支持的应用方向(心脏梗死区,皮肤缺损区等),可使用含载体干细胞补片制备方案(下图),利用脱细胞方法(专有技术),制备具有良好生物相容性和生物力学强度的脱细胞基质(心包膜,肠系膜,腹膜等)。利用该基质材料上保留下的胶原蛋白和蛋白多糖等天然成分交联适宜浓度的各种生长因子和微胶囊化的营养物质。按构建流程的需要调整生长因子和营养物质的缓释效果。使用纳米多肽凝胶作为临时性的细胞载体,按需要在混悬细胞时加入一定比例的转染过自杀基因的各种支持细胞(基质细胞、成纤维细胞或胚胎干细胞),待支持细胞的作用完成后,启动自杀基因,去除支持细胞,得到保持高增殖活性的纯净干细胞的细胞片。(发明专利申请号:201410620738.8)。

 

 

有载体干细胞补片制备方案模式图

☞比较优势表

干细胞-再生修复补片相关产品在国内外均处于起步阶段,虽已有产品在角膜创伤,皮肤创伤和脏器粘膜损伤方向开展临床试用,但尚未形成上市产品,而且由于应用最为广泛的温度反应性培养皿技术来源于日本专利,使得该类产品在中国市场的开展面临技术壁垒。本公司研发方案可打破日本科学家在该领域的技术垄断,并研发一种可维持干细胞生物学活性的新一代干细胞补片制备技术以及从干细胞中提取活性因子,进一步提高干细胞-再生修复补片的临床治疗效果和扩展其应用领域。

 

干细胞-再生修复补片技术比较

 

温皿细胞片

(日本专利)

干细胞-再生修复补片

(自主研发)

技术原理

温敏材料相变技术

纳米材料三维重建技术;多细胞共培养技术;基因工程技术;脱细胞产品制备技术;动态培养技术。

细胞活性

无维持干细胞活性方案

可维持干细胞活性,提高疗效

应用领域

成体细胞

成体细胞,干细胞

细胞层数

单层,单位面积细胞负载量不足

大于20层,单位面积细胞负载量大

构建时间

较长,需要多次叠加处理,制造20层细胞结构,需要2周以上。

较短,无需叠加操作,制造20层细胞结构,仅需2天。

生物力学

 无法维持力学性能,手术操作困难。

无载体细胞补片:纳米凝胶提高强度。
有载体细胞补片:具备天然组织强度。

干细胞生物
学活性

干分化\衰老\凋亡现象明显
细胞层数20层时,干细胞活性<45%,干细胞分化率>70%

 增殖活性较好,表型稳定。细胞层数20层时,
干细胞活性>95%,分化率<10%

培养方式

静态培养

动态培养 

附属设备

未开发相应支持设备

专有生物反应器

细胞片应用目的

创伤修复

组织再生,创伤修复

应用领域

较窄,主要用于成体细胞

较广泛,可用于制备技术难度较高的干细胞补片,对成体细胞同样适用。

生物安全性

存在非生理物质残留(聚丙烯酰胺类温敏材料:中等毒性物质)

不存在非生理物质残留

 

● 干细胞因子技术优势

☞现有技术方案

现有的提取技术包括离心法、超滤法、色谱法、免疫磁珠法。其中现有的超滤法为最常用技术,主要是在加压或者离心条件下,通过压力或离心力借助超滤膜的分离作用实现外泌体的浓缩,提高了分离的效率,但对外泌体及其内部的活性蛋白质有机械损伤;离心法是具体包含连续离心和梯度离心,此类方法操作简单,可以保留外泌体的活性,但产品纯度较低(一般在90%以下),产量低(一般只能达到ng级/L),提取费用昂贵,不适合产业化大规模生产。色谱法和免疫磁珠法虽然产品纯度高,但是产量很低(一般只能达到ng级/L),费用昂贵,只能满足实验室的科研需要,同样不适合大规模产业化生产。因此,需要研发一种既能大规模收集、收集效率高、对干细胞因子损伤小的提取、纯化方案。

 

☞本公司的创新

细胞培养:使用动态培养系统中连续灌注培养模式,调整各种系统参数,避免细胞衰老,保障干细胞各种生物学功能的维持,得到更多高质量的干细胞因子。干细胞因子收集:收集细胞培养过程中的培养液,使用滤器,除去细胞等。干细胞因子提取:借助透析器,不改变外泌体囊泡内外的渗透压,除去葡糖糖等小分子物质,在此过程中对生物大分子的物理及生物活性影响极小;使用蠕动泵提供动力,加快小分子的扩散作用,实现动态透析。干细胞因子纯化:将反复透析后的培养液冻干,在超纯水中再次透析,除去氯化钠、氯化钾等无机物,再次冻干即可得到高纯度的干细胞因子。

 

☞比较优势

干细胞-美容产品优势

 

生长因子产品

(国内外市场)

干细胞-美容产品

(本项目自主研发)

来源

大肠杆菌、酵母等原核生物

人源(极低的免疫原性)

成分

(重组型)生长因子

生长因子,干细胞特有修复蛋白(如外泌体,免疫调节蛋白)等

获得方式

原核生物中重组表达,分离

人源干细胞中直接提取

活性

强(100倍以上)

用途

单一(主要是化妆品市场)

多元化(化妆品市场,药妆市场,医学美容市场等)

产品形态

较单一

多样化(目前化妆品市场上现有产品形态都能参与)

主要功效

促生长作用

美白,抗衰老去皱,抗过敏,促血管生成促伤口愈合,唤醒皮肤细胞并调节皮肤细胞的转录增殖等

过敏反应

存在

不存在

依赖性

 

干细胞-美容产品技术优势

 

 

超滤法提取干细胞因子

新一代干细胞因子
提取方法

技术原理

在超滤膜一侧,使用氮气等施加压力,使小分子
过滤到超滤膜另一侧,保留大分子物质

小分子借助渗透压自由扩散,
蠕动泵带动更新透析液

蛋白活性

对蛋白质结构有机械损伤

对蛋白结构无破坏作用

提取时间

500mL/h(受容量限制)

1L/h(无容量限制)

操作可控性

不可控,加压后需等待液体分离

可以通过改变蠕动泵流速,调整提取速度

工作面积

41.8cm2(400mL容量,Millipore超滤杯超滤杯,超滤膜面积)

1.2m2以上,(微米级中空纤维表面积)

产物纯度

<88%

>95%

附属设备

专有超滤杯,超滤膜,需配套气瓶等

透析器、蠕动泵

生物安全性

压力环境,超滤膜破损概率极高,有安全隐患

分子自由扩散,无生物安全性问题